Fluorestsentsresonantsenergia ülekanne (FRET)
Fluorestsentsresonantsenergia ülekanne (FRET) on mittekiirguse energia ülekandeprotsess, mille käigus doonori ergastatud oleku energia kantakse molekulidevaheliste elektripaaride interaktsiooni kaudu aktseptori ergastatud olekusse.See protsess ei hõlma footoneid ja on seetõttu mittekiirguslik.Selle analüüsi eelised on kiire, tundlik ja lihtne.
FRET-testis kasutatav värv võib olla identne.Kuid enamikus rakendustes kasutatakse tegelikult erinevaid värvaineid.Lühidalt öeldes on valgusresonantsenergia ülekandmine dipoolide paari ülekandmine doonorilt (värv 1) aktseptorile (värv 2), kui doonorrühm on ergastatud.Üldiselt kattub doonori fluorofoorirühma emissioonispekter Aktseptori rühma neeldumisspektriga."Kui kahe fluorofoori vaheline kaugus on sobiv (10–100 A), saab jälgida fluorofoori energia ülekandumist doonorilt aktseptorile."Energiaülekande meetod sõltub retseptori keemilisest struktuurist:
1. Muutub molekulaarseks vibratsiooniks, st energiaülekande helendav valgus kaob.(Retseptor on valguse kustutaja)
2. Emissioon on intensiivsem kui retseptor ise, mille tulemuseks on punanihe sekundaarses fluorestsentsspektris.(Retseptorid on valguskiirgurid).
Doonorrühm (EDANS) ja aktseptorgeen (DABCYL) on ühtlaselt seotud HIV-proteaasi loomuliku substraadiga ja kui substraati pole lahti ühendatud, võib DABCYL kustutada EDANS-i ja muutuda seejärel fluori jaoks tuvastamatuks.Pärast HIV-1 proteaasi lahtiühendamist ei kustuta DABCYL enam EDANS-i ja EDANS-i lutsiferaase saab seejärel tuvastada.Proteaasi inhibiitorite kättesaadavust saab jälgida EDANS-i fluorestsentsi intensiivsuse muutustega.
FRET-peptiidid on mugavad vahendid peptidaasi mittespetsiifilisuse uurimiseks.Kuna selle reaktsiooniprotsessi saab pidevalt jälgida, on see mugav meetod ensüümi aktiivsuse tuvastamiseks.Pärast peptiidsidemete hüdrolüüsi doonori/aktseptori poolt tekitatud läige annab ensüümi aktiivsuse mõõtmise nanomolaarsetel kontsentratsioonidel.Kui FRET-peptiid on terve, näitab see sisemise välgu äkilist kadumist, kuid kui mõni doonori/aktseptori vastas olev peptiidside katkeb, vabastab see välgu, mida saab pidevalt tuvastada ja seejärel ensüümi aktiivsust kvantifitseerida.
Postitusaeg: 14. august 2023